Мук 4.2.2942-11 методы санитарно-бактериологических исследований объектов окружающей среды, воздуха и контроля стерильности в лечебных организациях 2021 год. последняя редакция

3.2. Исследования микробной обсемененности объектов внешней среды

3.2.1. Бактериологическое исследование микробной обсемененности объектов внешней среды предусматривает определение стафилококков, бактерий группы кишечных палочек, сальмонелл, синегнойной палочки. Отбор проб с поверхностей различных объектов осуществляют методом смывов. По эпидемиологическим показаниям номенклатура исследований микробной обсемененности объектов внешней среды может быть расширена.

3.2.2. Взятие смывов производят стерильными ватными тампонами, вмонтированными в пробирки. Для увлажнения тампонов в пробирки наливают по 2,0 мл стерильной 0,1 % пептонной воды с добавлением нейтрализаторов дезинфицирующих средств.

3.2.3. При контроле мелких предметов смывы забирают с поверхности всего предмета. При контроле предметов с большой поверхностью смывы проводят в нескольких местах исследуемого предмета общей площадью примерно 100 см2.

3.2.4. Для обнаружения стафилококков делают высев 0,2 — 0,3 мл смывной жидкости в пробирку с 5,0 мл 6,5 % солевого бульона. Засеянные пробирки инкубируют при 37 °С в течение (24 ± 2) ч, после чего делают высев на желточно-солевые среды на основе сред: элективно-солевой агар, стафилококкагар, манитолагар или среда № 10 по ГФ XII, агар Байд-Паркер. Дальнейшие исследования выделенных культур стафилококков проводят по п. .

3.2.5. Для обнаружения бактерий группы кишечных палочек делают высев 0,2 — 0,3 мл смывной жидкости в пробирку с 5,0 мл среды Кесслера. Засеянные пробирки инкубируют при 37 °С в течение (24 ± 2) ч и делают пересев на среду Эндо. Выросшие колонии на среде Эндо подвергают дальнейшему изучению для установления их возможной принадлежности к патогенным энтеробактериям.

3.2.6. Для обнаружения сальмонелл делают высев 0,2 — 0,3 мл смывной жидкости в пробирку с 5,0 мл одной из сред обогащения (магниевая, селенитовая или среда Раппапорта-Вассилиадиса). Засеянные пробирки инкубируют при 37 °С в течение 18 — 20 ч, делают пересев на среду Эндо и висмут-сульфит агар с последующим отбором подозрительных колоний и их идентификацией.

3.2.7. Для обнаружения синегнойной палочки делают высев на среду № 8 (бульон для накопления стафилококков и синегнойной палочки) и среду № 9 (для определения синегнойной палочки по наличию пигмента пиоцианина) или питательные среды в соответствии с ГФ XII. Колонии, подозрительные на синегнойную палочку (колонии с ровными или слегка волнистыми краями, гладкой блестящей поверхностью с характерным запахом и пигментом, однако, следует учесть, что запах и пигмент могут сильно варьировать или вообще отсутствовать), пересевают на скошенный агар.

P. aeruginosa — грамотрицательная, подвижная, оксидазоположительная палочка, окисляющая, но не ферментирующая глюкозу, дающая рост при 42 °С.

3.2.8. Ориентировочный перечень объектов, подлежащих санитарно-бактериологическому контролю методом смывов:

А. Операционный блок:

· интубационная трубка;

· маска наркозного аппарата;

· тройник наркозного аппарата;

· гофрированная трубка;

· ларингоскоп;

· роторасширитель;

· дыхательный мешок;

· емкости и приспособления для мытья и обработки рук;

· фартуки (клеенчатые или полиэтиленовые);

· рабочие столы;

· операционный стол;

· шланг вакуум-отсоса, внутренняя часть емкости;

· шланг кислородной подводки;

· клапан вдоха;

· стоики для введения лекарственных средств и вспомогательные приспособления;

· ручка бестеневой лампы;

· руки персонала, участвующего в операции;

· медицинские изделия многократного применения;

Б. Послеоперационные палаты, отделения, палаты реанимации и интенсивной терапии:

· кровать и постельное белье, подготовленные для больного;

· полотенца и приспособления для обработки рук персонала;

· руки персонала;

· шланг кислородной подводки;

· запасная наркозная аппаратура (набор реанимационной укладки);

· шланг вакуум-отсоса, внутренняя часть емкости;

· внутренняя поверхность шкафов и холодильников (для хранения лекарственных средств, градусников);

· медицинские изделия многоразового использования;

В. Перевязочные, процедурные:

· кушетка и приспособления для перевязок;

· полотенца и приспособления для обработки рук персонала;

· руки персонала;

· спецодежда персонала;

· мебель (медицинские столы, тумбочки);

· оборудование для химической стерилизации (стойки, чехлы для хранения стерильных эндоскопов, емкости с крышкой для химической стерилизации);

· гибкая часть эндоскопов и оптика;

· внутренняя поверхность шкафов и холодильников для хранения лекарственных препаратов и изделий медицинского назначения;

· внутренняя и наружная поверхности бактерицидных камер для хранения простерилизованных изделий медицинского назначения.

Среды для идентификации микроорганизмов

НРБИ «Питательная среда для контроля стерильности сухая (Тиогликолевая среда)»

НРБИ «Питательная среда № 1 ГРМ для количественного определения микробной загрязненности» 

НРБИ «Питательная среда № 2 ГРМ (Сабуро) для контроля микробной загрязненности  (для выращивания грибов)»

НРБИ «Питательная среда № 3 ГРМ для контроля микробной загрязненности (среда обогащения для бактерий семейства Enterobacteriaceae)»

НРБИ «Питательная среда № 6 ГРМ для контроля микробной загрязненности (для определения ферментации глюкозы)»

НРБИ «Питательная среда № 7 ГРМ для контроля микробной загрязненности (для определения восстановления нитратов в нитриты)»

НРБИ «Питательная среда № 8 ГРМ для контроля микробной загрязненности (для выращивания Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus)»

НРБИ «Питательная среда № 9 ГРМ для контроля микробной загрязненности (для выявления пигмента пиоцианина)»

НРБИ «Питательная среда № 10 ГРМ для контроля микробной загрязненности (для идентификации Staphylococcus aureus)»

НРБИ «Питательная среда № 11 ГРМ для контроля микробной загрязненности (лактозный бульон – среда для предварительного накопления бактерий семейства Enterobacteriaceae)»

НРБИ «Питательная среда № 13 ГРМ для контроля микробной загрязненности (трехсахарный агар с солями железа – для выявления сероводорода и определения ферментации лактозы, глюкозы, сахарозы)»

НРБИ «Питательная среда № 14 ГРМ для контроля микробной загрязненности (цитратный агар Симмонса)»

НРБИ «Питательная среда № 15 ГРМ  для контроля микробной загрязненности (для определения индола)»

Область применения

1.1. Настоящие методические указания
предназначены для специалистов органов, осуществляющих функции по контролю и
надзору в сфере обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия
населения, организаций и учреждений Роспотребнадзора, лечебно-профилактических
и других организаций независимо от организационно-правовой формы и формы
собственности.

1.2. Методические указания устанавливают
методы санитарно-бактериологических исследований в учреждениях здравоохранения,
других организациях лечебного профиля. Объектами санитарно-бактериологических
исследований, на которые распространяются настоящие методические указания,
являются:

· воздушная среда;

· объекты окружающей среды, в т.ч. изделия медицинского
назначения, зонды, катетеры, бужи, резиновые перчатки и другие изделия из резин
и металлов, шовный материал, подготовленный к использованию, и прочее,
спецодежда;

· руки персонала.

1.3.Номенклатура, кратность и
объем санитарно-бактериологических исследований устанавливается действующими
нормативно-методическими документами с учетом санитарно-эпидемиологической
обстановки.

1.4. Для санитарно-бактериологических
исследований объектов окружающей среды, воздуха и контроля стерильности изделий
медицинского назначения в учреждениях здравоохранения и других организациях
лечебного профиля могут быть использованы питательные среды лабораторного и
промышленного приготовления, расходные материалы, биологические препараты,
указанные в настоящих методических указаниях. Применение других коммерческих
питательных сред (расходных материалов, биологических препаратов) допускается
при наличии методик исследования, утвержденных и разрешенных к применению в
установленном порядке.

3.1.Исследования бактериальной обсемененности воздушной среды

3.1.1. Исследования бактериальной обсемененностивоздушной среды проводят в помещениях лечебных организаций в зависимости от ихфункционального назначения на санитарно-микробиологические показатели:

общее количество микроорганизмов в 1 м3воздуха (КОЕ/м3);

количество колоний S.aureus в 1 м3 воздуха (КОЕ/м3);

количество плесневых и дрожжевых грибов в1 м3 воздуха.

3.1.2. Пробы воздуха отбираютаспирационным методом с помощью аппаратов и устройств, разрешенных к применениюв установленном порядке.

Количество пропущенного воздуха должносоставлять 100 дм3 для определения общего количествамикроорганизмов, дрожжевых и плесневых грибов и 250 дм3 дляопределения S. aureus. Исследование воздуха седиментационным методом недопускается.

3.1.3. Для определения общего количествамикроорганизмов в 1 м3 воздуха забор проб проводят на питательныйагар типа МПА, СПА, ГРМ-агар и другие, приготовленные согласно инструкций поприменению. Посевы инкубируют при температуре 37 °С в течение (48 ± 2) ч,подсчитывают количество выросших колоний и производят перерасчет на 1 м3воздуха. При наличии роста колоний дрожжевых и плесневых грибов, ихподсчитывают и делают пересчет на 1 м3 воздуха. В протоколеколичество дрожжевых и плесневых грибов указывают отдельно.

Примечание: При переносе аппаратов иустройств для отбора проб воздуха из одного помещения в другое их поверхностьобрабатывают раствором дезинфицирующего средства. Столик, внутренние стыки,крышку и прочие части прибора с внутренней и внешней стороны протирают спиртом(70 %).

3.1.4. Схемабактериологического исследования на стафилококк.

1. Первый день.

Для определения наличия S.aureus забор проб проводят на желточно-солевые среды наоснове сред: элективно-солевой агар, стафилококк-агар, маннитолагар или среда №10 по ГФ XII, агар Байд-Паркер. Чашки с посевами инкубируют втермостате при 37 °С (48 ± 2) ч.

2. Второй-третий день.

На вышеуказанных средах стафилококкрастет в виде круглых, блестящих, маслянистых, выпуклых, пигментированныхколоний. Следует учитывать, что стафилококки, выделенные от человека, даютположительную лецитовителлазную реакцию в 60 – 70 % случаев. Отвивка наскошенный агар для дальнейшего исследования не менее 2 колоний, подозрительныхна стафилококк. Для исследования отвивают прежде всего колонии, дающие положительнуюлецитовителлазную реакцию (образование радужного венчика). При отсутствии начашках таких колоний дальнейшему исследованию подвергаются пигментированныеколонии, схожие по морфологии со стафилококком. При одновременном наличии начашках колоний стафилококка, отличающихся по пигменту, следует отвивать неменее двух колоний различного вида. Пробирки с посевом помещают в термостат при37 °С на (24 ± 2) ч.

3. Четвертый день.

После инкубации у выделенных штаммовпроверяют морфологию, тинкториальные свойства (окраска по Граму) и наличиеплазмокоагулирующей активности в реакции плазмокоагуляции (РПК).

Окраску по Граму проводят общепринятымметодом. Под микроскопом окрашенные по Граму стафилококки имеют видфиолетово-синих кокков, располагающихся гроздьями или небольшими кучками(«кружево»).

Если культура обладает толькоплазмокоагулирующей или только лецитовителлазной активностью, то дляокончательного ответа требуется учитывать другие признаки, позволяющиеопределить принадлежность штамма к виду S. aureus (ферментация маннита, гемолитическая активность).

При необходимости, после выделения чистойкультуры, проводят определение чувствительности/устойчивости к антибиотикам,дезинфицирующим средствам, бактериофагам.

4. Пятый день.

Учет результатов дополнительных тестов.Окончательная выдача ответа.

6.2. Подготовка бокса, инструментов и персонала к работе

6.2.1. Перед проведением работы
поверхности в помещениях бокса и предбоксника (стены, пол, оборудование и др.),
а также внутренние поверхности бокса сламинарным потоком воздуха
обрабатывают раствором дезинфицирующего средства, разрешенного к применению в
установленном порядке.

6.2.2. Через 45 — 60 мин после обработки
в бокс вносят все необходимые для работы материалы и инструменты, кроме
образцов изделий.

6.2.3. Перед началом работ бокс с
ламинарным потоком воздуха включают на время, достаточное для обеспечения
полного обмена воздуха, а затем помещают в него необходимый для работы
материал.

6.2.4. В боксе и предбокснике перед
работой включают бактерицидные облучатели.

6.2.5. Инструменты, посуду и спецодежду,
используемые в работе, предварительно стерилизуют при следующем режиме:
температура 32 °С,время стерилизационной выдержки — 90 мин; изделия из
резин (перчатки и т.д.) — при температуре 120 °С в течение 60 мин.

6.2.6. Перед посевом исследуемый материал
вносят в предбоксник, предварительно снимая наружную мягкую упаковку. В
предбокснике пакеты, биксы протирают снаружи с помощью стерильного пинцета
(корнцанга) стерильной салфеткой (ватным тампоном), обильно смоченной раствором
дезинфицирующего средства, обладающего спороцидными свойствами, разрешенного к
применению в установленном порядке, и оставляют на 30 мин. При поступлении
изделий, упакованных в два слоя (бумага, перманганаты, ткани), первый слой
снимают в предбокснике и изделия во внутренней упаковке сразу переносят в бокс.

6.2.7. Перед входом в бокс работники
лаборатории тщательно моют руки теплой водой с мылом, вытирают их стерильным
полотенцем (салфеткой), надевают в предбокснике бахилы, стерильные халаты,
4-слойные маски, шапочки и стерильные перчатки.

6.2.8. В процессе посева в боксе
проверяют обсемененность воздуха. Для этого на рабочий стол ставят 2 чашки с
мясопептонным агаром (МПА), открывая их на 15 мин, затем чашки помещают в
термостат при температуре 37 °С на (48 ± 2) ч. Допускается рост не более трех
колоний неспорообразующих сапрофитов.

7. Контроль стерильности питательных сред

Для контроля стерильности питательные
среды после изготовления и стерилизации помещают в термостат при температуре 37
°С на (48 ± 2) ч.

Бульон Сабуро контролируют полностью (всю
приготовленную серию пробирок или колб).

Для тиогликолевой среды термостатируют 1
% от общего числа приготовленных пробирок или колб каждой серии. Для проведения
исследований материала на стерильность эту часть сред не используют.

Мероприятия, обеспечивающие асептические условия при посевах

6.1.
Требования к помещению для посева на стерильность

6.1.1. Контроль стерильности изделий
проводят с соблюдением асептических условий, исключающих возможность вторичной
контаминации изделий микроорганизмами.

Контроль стерильности изделий проводят в
боксах с ламинарным потоком воздуха. При отсутствии боксов с ламинарным потоком
воздуха контроль стерильности проводят в боксированных помещениях (бокс с
предбоксником).

6.1.2. В боксированном помещении
поверхность пола, стен, потолка, мебели должна быть гладкой, без щелей,
устойчивой к многократному действию моющих и дезинфицирующих средств. Полы должны
быть нескользкими, иметь гидроизоляцию. Поверхность столов не должна иметь швов
и трещин.

6.1.3. Боксы оборудуют приточно-вытяжной
вентиляцией (с преобладанием притока над вытяжкой) с подачей в них воздуха
через бактериальные фильтры. В боксе и предбокснике устанавливают бактерицидные
облучатели в соответствии с нормами, предусмотренными действующими
нормативно-методическими документами.

6.2. Подготовка бокса, инструментов и персонала
к работе

6.2.1. Перед проведением работы
поверхности в помещениях бокса и предбоксника (стены, пол, оборудование и др.),
а также внутренние поверхности бокса сламинарным потоком воздуха
обрабатывают раствором дезинфицирующего средства, разрешенного к применению в
установленном порядке.

6.2.2. Через 45 — 60 мин после обработки
в бокс вносят все необходимые для работы материалы и инструменты, кроме
образцов изделий.

6.2.3. Перед началом работ бокс с
ламинарным потоком воздуха включают на время, достаточное для обеспечения
полного обмена воздуха, а затем помещают в него необходимый для работы
материал.

6.2.4. В боксе и предбокснике перед
работой включают бактерицидные облучатели.

6.2.5. Инструменты, посуду и спецодежду,
используемые в работе, предварительно стерилизуют при следующем режиме:
температура 32 °С,время стерилизационной выдержки — 90 мин; изделия из
резин (перчатки и т.д.) — при температуре 120 °С в течение 60 мин.

6.2.6. Перед посевом исследуемый материал
вносят в предбоксник, предварительно снимая наружную мягкую упаковку. В
предбокснике пакеты, биксы протирают снаружи с помощью стерильного пинцета
(корнцанга) стерильной салфеткой (ватным тампоном), обильно смоченной раствором
дезинфицирующего средства, обладающего спороцидными свойствами, разрешенного к
применению в установленном порядке, и оставляют на 30 мин. При поступлении
изделий, упакованных в два слоя (бумага, перманганаты, ткани), первый слой
снимают в предбокснике и изделия во внутренней упаковке сразу переносят в бокс.

6.2.7. Перед входом в бокс работники
лаборатории тщательно моют руки теплой водой с мылом, вытирают их стерильным
полотенцем (салфеткой), надевают в предбокснике бахилы, стерильные халаты,
4-слойные маски, шапочки и стерильные перчатки.

6.2.8. В процессе посева в боксе
проверяют обсемененность воздуха. Для этого на рабочий стол ставят 2 чашки с
мясопептонным агаром (МПА), открывая их на 15 мин, затем чашки помещают в
термостат при температуре 37 °С на (48 ± 2) ч. Допускается рост не более трех
колоний неспорообразующих сапрофитов.

АППАРАТУРА, МАТЕРИАЛЫ И ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ

Термостат, обеспечивающий температуру нагрева (37 + 0,5) °С и (21 + 1) °С.

Шкаф сушильный. pH-метр электрометрический.

Дистиллятор.

Штативы дюралюминиевые.

Пипетки мерные вместимостью 1 и 2 см3 по НТД.

Пробирки стеклянные по ГОСТ 25336.

Флаконы стеклянные вместимостью 100 см3.

Воронки стеклянные по ГОСТ 25336.

Кастрюли разной вместимости.

Груши резиновые.

Бумага фильтровальная по ГОСТ 12026.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Масло вазелиновое по ГОСТ 3164.

Раствор изотонический с массовой долей хлористого натрия 0,9 %.

Аммиак водный по ГОСТ 3760, раствор с массовой долей 10 %.

Кислота соляная по ГОСТ 3118, раствор с массовой долей 1 %—2 %.

Водорода перекись, раствор с массовой долей 3 %.

Хлорамин, раствор с массовой долей 2 %, или фенол, раствор с массовой долей 3 %, или анти-септол, раствор.

Издание официальное Перепечатка воспрещена

Издательство стандартов, 1989 Стандартинформ, 2007

Антисептол готовят следующим образом: раствор хлорной извести с массовой долей 50 % и раствор кальцинированной соды с массовой долей 5 % сливают в равных объемах и перед употреблением разбавляют водой в соотношении 1:50.

Известь хлорная с массовой долей активного хлора не менее 32 %.

Сода кальцинированная по ГОСТ 83.

Натрия гидроокись по ГОСТ 2263.

Фуксин основной.

Калий йодистый по ГОСТ 4232.

Йод кристаллический по ГОСТ 4159.

Порошок стиральный.

Среда тиогликолевая; готовят следующим образом: 15 г панкреатического гидролизата казеина; 5 г дрожжевого экстракта; 2,5 г хлористого натрия; 5,0 г глюкозы; 0,75 г цистина; раствора реза-зурина натрия 1:1000 свежеприготовленного 1 см3; 0,3 см3 тиогликолевой кислоты или 0,5 см3 тиогликолята натрия; 0,75 см3 агара доводят до 1000 см3 дистиллированной водой. Среду автоклавируют при 120 °С в течение 20 мин, pH среды 7,0 + 0,2.

Бульон казеиновый питательный с массовой долей глюкозы 0,5 %. Готовят следующим образом: смешивают 15 г панкреатического гидролизата казеина или пептона Мартена, 5 г дрожжевого экстракта, 5 г хлористого натрия доводят до 1000 см3 дистиллированной водой. Смесь подщелачивают раствором гидроокиси натрия с массовой долей до 20 %, до pH 8,0—8,2, кипятят на открытом огне в течение 10—15 мин или автоклавируют при 110 °С в течение 30 мин, фильтруют, прибавляют 5 г глюкозы, устанавливают pH 7,3—7,5, разливают в стерильные пробирки и стерилизуют при 110 °С—112 °С в течение 30 мин.

Агар казеиновый питательный с массовой долей глюкозы 0,5 %. Готовят так же, как и казеиновый питательный бульон, и добавляют 10—20 г агар-агара.

Бульон казеиновый питательный с массовой долей глюкозы 0,5 %, агара 0,2 % и кусочками печени (мяса) под вазелиновым маслом. Готовят на основе казеинового питательного бульона с 0,5 % глюкозы, добавляя 0,2 % агар-агара и 0,5 см3 вазелинового масла. Готовую среду разливают в стерильные пробирки, добавляют 0,5 см3 стерильного вазелинового масла, 3—4 кусочка мяса или печени и стерилизуют при 110 °С—112 °С в течение 30 мин, pH среды — 7,2—7,4.

Бульон мясо-пептонный с массовой долей глюкозы 0,5 % (МПБ) по ГОСТ 20730.

Агар мясо-пептонный с массовой долей глюкозы 0,5 % (МПа).

Бульон мясо-пептонный печеночный под вазелиновым маслом с массовой долей глюкозы 0,5 %, агара 0,2 % (среда Тароцци).

Среда Сабуро; готовят следующим образом: в 1000 см3 дистиллированной воды добавляют 10 г сухого ферментативного пептона, кипятят в течение 10 мин, фильтруют, прибавляют 40 г глюкозы или мальтозы, устанавливают соляной кислотой с массовой долей 1—2 % pH 5,8, разливают в стерильные пробирки и стерилизуют при 110 °С в течение 30 мин.

Агар микробиологический по ГОСТ 17206.

Пептон сухой ферментативный по ГОСТ 13805.

Казеина гидролизат панкреатический или пептон Мартена.

Экстракт дрожжевой.

Натрий хлористый по ГОСТ 4233.

Глюкоза или мальтоза по ГОСТ 6038.

Цистин.

Кислота тиогликолевая.

Натрия тиогликолат.

Натрия резазурин.